Лабораторная диагностика. Ветеринарная биохимия

Статья Е.Б. Бажибиной «Методический подход к интерпретации результатов биохимических исследований» в Российском ветеринарном журнале. Мелкие домашние и дикие животные, № 2, 2012 г., стр. 8-14.

Бажибина Елена Борисовна,
лаборатория «ВЕТЕСТ», Москва, Россия

Резюме

С появлением на отечественном рынке автоматического оборудования биохимический анализ сыворотки крови мелких домашних животных прочно вошел в повседневную практику ветеринарного врача. Сегодня постановка диагноза и мониторинг животных с заболеваниями внутренних органов (острая/хроническая почечная недостаточность, гепатит, панкреатит; эндокринологические патологии, нарушения минерального обмена и многое другое) практически невозможны без биохимического исследования.

Если анализы выполнены в одной лаборатории и, что особенно важно, если есть возможность проконсультироваться у врача-лаборанта относительно интерпретации полученных результатов, а также влияния на них физиологического состояния животного, условий взятия материала, транспортировки и т. д., то практикующий врач, как правило, не испытывает затруднений в постановке диагноза. Однако в повседневной практике приходится иметь дело с пациентами, поступающими на прием с целым «послужным списком», т. е. с результатами анализов, выполненных в нескольких лабораториях, различающихся по референсным значениям (диапазоны по каждому показателю, принятые в качестве нормы в конкретной лаборатории).

Как практикующему врачу оценить результаты биохимического анализа сыворотки крови, выполненного в лабораториях, оснащенных разным оборудованием, использующих различные методики? Как сравнивать референсные значения разных лабораторий и разные единицы измерения биохимических показателей? Эти и другие вопросы рассмотрены в данной статье.

Общие положения

По нашим наблюдениям, первое, на что обращают внимание врачи, оценивая результаты биохимического анализа, соответствуют ли показатели крови данным, полученным при клиническом исследовании пациента. Это неверный диагностический путь, поскольку выводы на основании такого сравнения полностью зависят от квалификации врача-клинициста. Необходимо придерживаться тактики комплексной постановки диагноза, согласно которой важно учитывать результаты широкого спектра исследований – клинического (осмотр, аускультация и т. д.), инструментального (ультразвукового, рентгенологического и т. д.), лабораторного (клинический и биохимический анализы крови, клинический анализ мочи), а также данных анамнеза.

Суммируя опыт коллег и свой собственный, можно сказать, что при оценке результатов биохимического анализа важно учитывать целый ряд факторов:1) референсные значения, принятые в лаборатории; единые коэффициенты пересчета (см. приложение); 2) особенности пациента – физиологические (возраст, пол, порода, стадия полового цикла) и поведенческие (в момент взятия крови и др.); 3) потенциальное воздействие терапевтических препаратов и иных факторов на показатели крови; 4) особенности транспортировки образца крови (соблюдались ли правила), дата/время взятия образца, проведения исследования; 5) отметки в бланке результатов о наличии в образце крови отклонений, способных исказить результат анализа(гемолиз, гиперлипидемия и др.); 6) особенности методик и оборудования, на котором выполнено исследование; 7) регулярный внешний контроль качества работы оборудования и соблюдение внутреннего регламента лаборатории, репутация в профессиональной среде; 8) возможность обращения в лабораторию, предоставившую результаты исследований, за консультацией специалиста о возможных причинах изменений показателей крови. Нужно учитывать и тот факт, что в задачи врача-лаборанта входит описание показателей крови, но не постановка диагноза, это является прерогативой врача-клинициста.

Референсные значения, принятые в лаборатории, единые коэффициенты пересчета

Референсные значения всех показателей каждая лаборатория определяет с учетом имеющегося оборудования, используемых методик и соответствующих калибровочных и контрольных материалов, а также справочных данных по всем параметрам крови и результатов контрольных исследований крови здоровых животных, проведенных для апробации каждого вида анализа. Существуют международные единицы (СИ) для ха-рактеристики параметров крови (ГОСТ 8.417-2002), принятые Международной Метрической Конвенцией. Результаты исследований, предназначенные для оценки врачами-клиницистами, надежные лаборатории предоставляют в единицах, сопоставимых с данными других лабораторий или приводят пересчетные коэффициенты.

Физиологические факторы, влияющие на биохимические показатели крови

К этим факторам относят возрастные, половые и породные особенности. Самые существенные различия в нормальных значениях показателей связаны с возрастом животных. Отклонения от средневидовой нормы (принятой в литературе) у молодых и старых животных могут составлять 25…100 % и более.

Рис. 1. Динамика изменения биохимических показателей в крови молодых животных.

Наиболее значимые различия в физиологических параметрах крови выявляют при сравнении молодых и взрослых животных.

Изменения нормальных значений биохимических показателей крови, ассоциированные с возрастом и полом, обусловлены различиями в активности обменных процессов, в гормональном фоне, функциональной зрелости организма.

Возраст. У молодых животных по сравнению со взрослыми из-за относительно невысокой ферментативной активности печени, более высокого содержания плазмы на единицу объема крови, ускоренного синтеза белка снижены значения многих параметров белкового и ферментативного обменов (рис. 1): АлАТ, АсАТ, фибриноген, общий белок, альбумин, амилаза. Пониженное содержание мочевины обусловлено сочетанием ускоренного анаболизма белка и возрастной полидипсии и полиурии. Концентрация креатинина снижена вследствие малой массы тела [23]. Любое увеличение содержания мочевины и креатинина в сыворотке следует рассматривать в соотношении с удельным весом мочи [13]. Низкая концентрация холестерина в крови животных в возрасте до 6 мес. обусловлена высокой скоростью его расходования, что вызвано ускоренным ростом тканей, половым развитием и синтезом стероидных гормонов.

У молодых собак (у кошек в меньшей степени) повышены (относительно средневидовых норм) значения показателей минерального обмена – концентрация кальция и фосфора (вследствие активного роста скелета и высокой активности гормона роста). Активность ЩФ и ГГТ у щенков до 10-дневного возраста выше, чем у взрослых в 20…25 раз (могут достигать 8760 U/L и 3558 U/L соответственно). Активность данных ферментов возрастает в течение 24 ч после рождения и отражает интенсивность поглощения молозива, богатого ферментами, в то же время тканевые факторы в молозиве могут стимулировать эндогенный синтез ЩФ и ГГТ. Поэтому в первые дни жизни данные показатели нельзя использовать в диагностике расстройств гепатобилиарной системы. ЩФ и ГГТ могут служить критерием потребления щенками молозива. Начиная с 2-х недельного возраста щенка активность ЩФ и ГГТ в сыворотке крови снижается до 176…541 U/L и4…77 U/L, соответственно, и в возрасте 4-х недель до-ходит до 135…201 U/L и 2…7 U/L, соответственно [5].

Значения ЩФ могут превышать норму в 2…2,5 раза в период активного роста, особенно у собак крупных пород, за счет высокой активности костного изофермента. У котят в сыворотке крови увеличение активности ЩФ и ГГТ, в отличие от щенков, после приема молозива не наблюдают.

Более высокими у молодых животных, вследствие роста синтеза иммуноглобулинов, бывают показатели, связанные с иммунным статусом (глобулины, лимфоциты).

Во взятой натощак крови уровень желчных кислот у щенков и котят в возрасте 2-х мес. не имеет существенных отличий от взрослых животных. Однако во взятой натощак крови и сыворотке после приема пищи отмечена гипераммониемия (до 365 и 568 μmol/L соответственно) у здоровых щенков ирландского волкодава от 6-недельного возраста с нормализацией концентрации аммиака в 3…4-месячном возрасте [13]. Диапазон физиологических концентраций натрия, калия, хлора у молодых собак и кошек соответствует нормам для взрослых животных [9].

Пол и порода. Традиционно разные условия содержания и кормления животных, выведение пород в разных географических местностях накладывают отпечаток на метаболические процессы в организме и даже определяют предрасположенность к некоторым заболеваниям на генетическом уровне. У самок ниже концентрация холестерина, а также активность большинства ферментов (АлАТ, КФК), но выше содержание фосфора и желчных кислот [4].

Существование породной вариабельности у кошек подтверждены многими исследователями и наблюдением врачей-клиницистов. Выявлена породная предрасположенность к определенным заболеваниям (например, кошки бирманской породы чаще заболевают вирусным инфекционным перитонитом или сахарным диабетом) [14, 17, 20, 21]. Достоверно доказано, что у бирманских кошек более широкий референсный интервал креатинина [10]. При исследовании у кошек разных пород содержания глюкозы, мочевины, креатинина, протеина, альбумина, кальция, фосфора, натрия, калия, хлора, активности АлАТ, ЩФ наиболее значимые различия были выявлены в содержании креатинина, глюкозы, общего белка у кошек таких пород, как бирманская, шартрез, мейнкун и персидская. У здоровых кошек данных пород средние значения показателей были сопоставимы с референсными, а верхние границы показателей увеличены на 20…25 % [10, 12, 15].

Породные различия у собак более выражены, чем у кошек, что объясняется большими колебаниями в массе тела (от чихуахуа до ирландского волкодава), условиями содержания (комнатные собачки, гончие, охотничьи, сторожевые и т. д.). При исследовании стерилизованных собак среднего возраста (маламут, хас-ки, голден ретривер, английский сеттер) отмечено, что средние значения показателей примерно одинаковые, зато значения верхней и нижней границы существенно различаются (разброс):

• креатинин: маламут и голден ретривер – до133 μmol/L, референсные значения у всех исследуемых пород – 88…106 μmol/L;

• мочевина: английский сеттер – до 11,4 mmol/L, среднее значение по всем породам – 2,9…8,9 mmol/L [6];

• магний: голден ретривер – нижняя граница 0,58 mmol/L, среднее значение 0,62…0,9 mmol/L;

• глобулин: маламут – до 45 g/l, референсные значения 24…38 g/l;

• ЩФ: хаски – до 203 U/L, сеттер – до 117 U/L ,референсные значения 10…92 U/L. По данным зарубежных коллег, эти породы склонны к гепатопатиями холестазу [18]; завышенные значения ЩФ могут быть связаны с атипичным адренокортицизмом, к которому склонны собаки породы сеттер [24];

• ГГТ: сеттер – до 11,0 U/L, норма 1…6 U/L;

• глюкоза: хаски – до 7,2 mmol/L, среднее значение 4,2…6,4 mmol/L;

• холестерин: маламут – до 9,38 mmol/L, сеттер –до8,73, средние значения 3,55…8,75 mmol/L;

• амилаза: ретривер – до 1158 U/L, сеттер –до 1293, средние значения 162…974 U/L.

Существуют данные по увеличению активности АлАТ, АсАТ и ГГТ у гончих с возрастом и в зависимости от физической нагрузки [16].

У собак породы бернский зиненхунд при сравнении 21 биохимического показателя от принятых референсных значений отличались ЩФ – до 464 U/L, референсные до 174 U/L, амилаза – 285…1255 U/L, референсные 186…798 U/L; холестерин – 5,29…10,08 mmol/L, референсные 3,5…6,99 mmol/L [11]. Надо отметить, что более высокая активность амилазы без соответствующего повышения активности липазы малоинформативна, а более высокая концентрация холестерина может быть истолкована как предрасположенность к нефропатиям. Кроме того, собаки породы зинненхунд предрасположены к злокачествен-ному гистиоцитозу, течение которого негативно влияет на печень, об этом может свидетельствовать и повышение активности ЩФ [22].

У собак породы борзая значительно выше значения креатинина (до 186 μmol/L) и КФК, причем повышение значений этих показателей находятся в прямой зависимости от физической нагрузки [8]. Активность печеночных ферментов – АлАТ, АсАТ, ЩФ у них также значительно выше, чем референсные значения для собак в целом, увеличено рСО2 без явных признаков алкалоза. У активно работающих собак снижены показатели кальция, фосфора, тиреодных гормонов (Т4 и Т4 свободный), но повышена концентрация глюкозы по сравнению с референсными значениями [16].

Наилучший способ выявить отклонения от физиологических норм у каждого конкретного животного – это оценивать параметры крови в динамике (при регулярном диспансерном исследовании, начиная с молодого возраста).

Различия результатов биохимического анализа в зависимости от оборудования

До 70 % ошибок, искажающих результаты исследований, связаны с преаналитическим этапом (табл. 1). Присутствие в сыворотке посторонних частиц искажает результаты фотометрии, т. к. метаболиты разрушенных клеток, пигменты, крупномолекулярные соединения могут вступать в реакцию с определяемым веществом или компонентами рабочего реактива, влиять на активность ферментов [1, 25].

Таблица 1. Погрешности преаналитического этапа.

Хилез – помутнение сыворотки/плазмы крови, обусловленное содержанием в ней большого количества жиров; ведет к завышению значений печеночных трансфераз; глюкозы, билирубина, холестерина, триглицеридов, желчных кислот, амилазы и др.; к занижению значений натрия, хлора, ГГТ.

Гемолиз – избыточный выход гемоглобина в сыворотку крови вследствие разрушения эритроцитов; ведет к завышению значений билирубина, КФК, альбумина, протеина, АлАТ; к занижению показателей ЩФ, желчных кислот, амилазы, ГГТ и т.д.

Прием лекарственных препаратов может сопровождаться изменением течения патологических процессов и сдвигами определенных показателей, относительно физиологической нормы. Например: сульфаниламиды приводят к повышению концентрации билирубина, преднизолон – глюкозы; фенобарбитал – увеличению активности печеночных транфераз; цефалоспорины обусловливают положительную реакцию на глюкозу в моче [2].

Напомним, что билирубинемия – повышенное содержание билирубина в крови, отражает патологические процессы, происходящие в организме, сопровождающиеся значительным разрушением функциональных элементов печени (гепатоцитов), увеличением активности печеночных трансфераз, содержания пигментов печени и понижением количества синтезируемых в печени веществ (альбумина, холестерина и др.). Повышенное содержание билирубина в крови характеризует патологические процессы, происходящие в организме, а не ошибки преаналитического этапа.

Автоматическое оборудование для биохимического анализа

Существует несколько типов биохимических анализаторов, принципиально различающихся по применяемым методикам. В зависимости от используемых реагентов различают биохимические анализаторы на жидких реагентах, или «жидкая химия», и использующие «сухую» химию, которые в свою очередь подразделяются на «сухую» стриповую и «сухую» слайдовую. Каждый из этих типов имеет свои особенности, преимущественно касающиеся технических аспектов установленных методик, оценки получаемых результатов, возможных погрешностей под действием различных внешних факторов.

Рис. 2. Принцип трансмиссионной спектроскопии, используемой в «жидкостных» анализаторах.

Анализаторы, основанные на использовании сухих реагентов в качестве «стрипов», малоинтересны для биохимического анализа крови. Их недостатки: высокая погрешность результатов, большое число факторов, способных повлиять на результат, невозможность достойного контроля качества и низкая сопоставимость результатов. Примером могут служить анализаторы для клинического исследования мочи и портативные глюкометры.

Анализаторы, использующие жидкие реагенты, широко распространены в медицине человека и достаточно давно применяются в ветеринарной медицине. Анализаторами этого типа оснащены крупные лаборатории и научно-исследовательские центры. Принцип работы большинства фотометров и биохимических анализаторов «жидкой» химии основан на турбидиметрическом методе (измерение интенсивности света, прошедшего через анализируемую суспензию). Основные погрешности, сопутствующие данному методу (при условии качественной калибровки) могут быть связаны с частичным отражением света от поверхностей кюветы. Статистически доказанная погрешность – уменьшение значений около 9,2 %, что учитывают в методиках [1]. Многоразовое использование кювет и роторов обусловливает погрешность при исследовании минерального состава сыворотки крови (за счет примесей воды). К увеличению значений плотности исследуемого раствора (сыворотки, мочи) приводят и различные примеси органического и неорганического происхождения (разрушенные клетки, белки, жиры, частицы шерсти и пыли), которые уменьшают интенсивность регистрируемого фотодиодом проходящего света, а при пересчете увеличивают значение определяемого параметра (рис. 2).

Анализаторы «сухой» химии получают все большее распространение и в медицине и в ветеринарии, что обусловлено изобретением и внедрением слайдовой технологии, позволяющей минимизировать артефакты (хилез, остатки разрушенных клеток, загрязнение пробы микрочастицам пыли и т. д.). Слайдовая технология биохимического анализа сыворотки крови незаменима в условиях небольших клиник и ветеринарных кабинетов, при возникновении экстренных состояний, когда нет возможности или времени доставить пробы в лабораторию, а результаты нужны срочно.

Рис. 3. Принцип рефлектометрической (отражательной) спектроскопии стриповой (а) и слайдовой (б) технологий.

Принцип слайдовой технологии основан на измерении и оценке отраженного (а не проходящего, как в «жидкостных» анализаторах) света. Технология слайда предусматривает несколько слоев, через которые проходит исследуемый образец. После распределения образца на первом слое, на втором происходит фильтрация крупномолекулярных соединений. Таким образом, на реакционный слой попадают только компоненты с малой молекулярной массой. Третий слой – индикационный (реакционный), где происходит реакция и с которого считываются данные по изменению окраски и оптической плотности, исключая, таким образом, воздействие многих артефактов (рис. 3, 4). Измеренная оптическая плотность преобразуется в значение концентрации на основе калибровочной кривой, имеющейся в памяти анализатора.

Рис. 4. Расположение слоев слайда.

Для практикующего ветеринарного врача могут быть интересны некоторые принципиальные отличия анализаторов, использующих для исследований «сухую» и «жидкую» химию (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительные параметры анализаторов «сухой» и «жидкой» химии.

Если врач получает результат, выходящий за пределы линейности установленной методики, надо иметь в виду, что при подсчете данного показателя сыворотка была разведена и, следовательно, погрешность измерения увеличилась.

Мы постарались осветить некоторые аспекты биохимического анализа крови, способные влиять на получаемый результат. Для контроля результатов некорректно дублировать анализ в другой лаборатории, особенно спустя несколько дней, т. к. там могут быть принципиально другие оборудование и установленные методики. В качестве рекомендации хочется напомнить, что уточнить «непонятные» можно с помощью дифференциальных (дополнительных) тестов или процедур (пример: при превышающей физиологические норму глюкозе рекомендуют исследовать фруктозамин или гликерированный гемоглобин; при повышении почечных показателей – функциональные тесты почечной фильтрации: фракционной экскреции электролитов, скорости клубочковой фильтрации и прочее).

Приложение. Коэффициенты пересчета единиц.

Библиография

1. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике, 3-е изд., Москва, изд. «МЕДпресс-информ», 2009, 196с.
2. Меньшиков В.В. Критерии оценки методик и результатов клинических лабораторных исследований, справочное пособие: - Москва, изд. Лабора, 2011. – 328с.
3. Словарь-справочник. — Москва, Издательство стандартов, 1990, ISBN 5-7050-0118-5
4. Butterwick RF, McConnell M, et al. Influence of age and sex on plasma lipid and lipoprotein concentrations and associated enzyme activities in cats. Am J Vet Res 62:331-336, 2001.
5. Center SA, Randolph JF, et al. Effect of colostrum ingestion on gamma-glutamyltransferase and alkaline phosphatase activities in neonatal pups. Am J Vet Res 52:499-504, 1991.
6. Concordet D, Vergez F, Trumel C, et al. A multicentric retrospective study of serum/plasma urea and creatinine concentrations in dogs using univariate and multivariate decision ruled to evaluate diagnostic efficacy. Vet Clin Pathol. 2008; 37:96–103.
7. Dunlop MM, Sanchez-Vazquez MJ, Freeman KP, Gibson G, Sacchini F, Lewis F. Determination of serum biochemistry reference intervals in a large sample of adult greyhounds. J Small Anim Pract.
8. Gunn-Moore DA, Dodkin SJ, Sparkes AH. An unexpectedly high prevalence of azotemia in Birman cats (letter). J Feline Med Surg 2002;4:165–166.
9. Driscoll CA, Menotti-Raymond M, Roca AL, et al. The Near Eastern origin of cat domestication. Science 2007;27:519–523.
10. Fettman MJ and Allen TA. Developmental aspects of fluid and electrolyte metabolism and renal function in neonates. Comp Contin Ed Pract Vet 13:392-403, 1991.
11. Jubb KVF. The Pancreas. In: Jubb KVF, Kennedy PC, Palmer N, eds. Pathology of Domestic Animals. 1st ed. San Diego, CA: Academic Press Inc.; 1993:407–424.
12. Harper EJ, Hackett RM, Wilkinson J, et al. Age-related variations in hematologic and plasma biochemical test results in Beagles and Labrador Retrievers. J Am Vet Med Assoc 2003;223.
13. Hoskins JD. Veterinary Pediatrics. Dogs and Cats from Birth to Six Months (3rd ed.), WB Saunders Company, Philadelphia, 2001.
14. Lederer R, Rand JS, Jonsson NN, et al. Frequency of diabetes mellitus and breed predisposition in domestic cats in Australia. Vet J 2009;179:254–258.
15. Lipinski MJ, Froenicke L, Baysac KC, et al. The ascent of cat breeds: Genetic evaluations of breed and worldwide randombreed populations. Genomics 2008;91:12–21.
16. Lowseth LA, Gillett NA, Gerlach RF, Muggenburg BA. The effects of aging on hematology and serum chemistry values in the beagle dog. Vet Clin Pathol. 1990;19:13–19.
17. McCann TM, Simpson KE, Shaw DJ, et al. Feline diabetes mellitus in the UK: The prevalence within an insured cat population and a questionnaire-based putative risk factor analysis. J Feline Med Surg 2007;9:288–299.
18. Nestor DD, Holan KM, Johnson CA, SchallW, Kaneene JB. Serum alkaline phosphatase activity in Scottish
19. Terriers versus dogs of other breeds. J Am Vet Med Assoc.,
20. Pesteanu-Somogyi LD, Radzai C, Pressier BM. Prevalence of feline infectious peritonitis in specific cat breeds. J Feline Med Surg 2006;8:1–5.
21. Whincup PH, Gilq JA, Owen CG, et al. British South Asians aged 13–16 years have higher fasting glucose and insulin levels than Europeans. Diabet Med 2005;22:1275–1277.
22. Reusch C, Hoerauf A, Lechner J, et al. A new familial glomerulonephropathy in Bernese mountain dogs. Vet Rec. 1994;134:411–415.
23. Zandvliet MMJM and Rothuizen J. Transient hyperammonemia due to urea cycle enzyme deficiency in Irish wolfhounds. J Vet Intern Med 21:215-218, 2007.
24. Zimmerman K, Panciera D, Panciera R. Hyperalkaline phosphatemia in Scottish Terriers caused by atypical adrenal cortical disease [abstract]. Vet Clin Pathol.
2007;36:312.