• +7 (495) 232-02-13
  • г. Москва, ул. Саморы Машела, 8/2
             Время работы: пн-пят, 8.00-17.00


Диагноз по обломкам ДНК

Сравнение агентов для стабилизации внеклеточной ДНК


Циркулирующая в плазме ДНК все чаще используется для генетического тестирования в научных и клинических исследованиях. При этом если работают со стандартными пробирками для сбора крови, то проявляется серьезная проблема - быстрый лизис белых кровяных клеток через несколько часов после венепункции. В результате, в плазму попадает геномная ДНК из разрушенных клеток и загрязняет циркулирующую в плазме внеклеточную ДНК. Это может затруднить анализ плазменной ДНК и привести к неточностям в определении редких мутантных молекул. Кроме того, нуклеазы, присутствующие в крови, также могут разрушать плазменную ДНК. Агенты для стабилизации клеток могут предотвращать клеточный лизис на несколько дней, снижая необходимость немедленной подготовки плазмы после венепункции, тем самым облегчая сбор образцов крови и их подготовку для исследований.

Представляем сравнительный анализ того, как различные клеточные стабилизаторы обеспечивают целостность циркулирующей в плазме ДНК.

Оценивались клеточные стабилизаторы в специальных пробирках для выделения внеклеточной ДНК (Streck BCT) и геномной ДНК (производитель Q.), в сравнении со стандартными ЭДТА пробирками. Анализ проводился на образцах крови беременных женщин (эмбриональная ДНК) и на образцах крови пациентов с метастатическим раком молочной железы (РМЖ). При этом сравнивались количества (геномные эквиваленты) ДНК плазмы с помощью капельной цифровой ПЦР (droplet digital PCR, ddPCR).


 

Циркулирующая в плазме внеклеточная ДНК

Использование плазменной ДНК в диагностических целях тщательно изучено и внедрено в перинаталогии, где теперь используют материнскую кровь, содержащую эмбриональную ДНК, для диагностики генетических нарушений плода еще в утробе матери.


С другой стороны, известно, что клетки организма выделяют ДНК в систему кровообращения. 

Было показано, что плазма крови пациентов с онкологией содержит небольшое количество фрагментированной ДНК опухолевого происхождения (ctDNA), которая выделяется в кровоток в результате некроза и апоптоза клеток опухоли. 

Появилось новое направление в онкодиагностике - исследование циркулирующей в плазме внеклеточной опухолевой ДНК (ctDNA) для выявления мутаций в качестве специфических маркеров ранних и поздних стадий рака («жидкая биопсия»).

Неинвазивная «жидкая биопсия» позволяет в реальном времени анализировать геном опухоли, и, таким образом, наблюдать за течением заболевания. При этом если игла для биопсии берет на исследование только небольшую часть опухоли, то образец крови содержит ДНК, представляющую каждую раковую клетку в организме.


 


Эмбриональная циркулирующая ДНК

Оценка стабилизатора для циркулирующей ДНК в пробирках Streck BCT


Была подтверждена способность пробирок Streck BCT сохранять целостность циркулирующей ДНК плода в материнской крови через несколько дней после венепункции при хранении при комнатной температуре. В качестве материала для анализа использовали кровь, полученную у женщины на 7-м месяце беременности плодом мужского пола. Использовали цифровую капельную ПЦР (ddPCR) с зондами, специфичными к гену Y-хромосомы E1F1AY и эталонному гену PIK3CA дикого типа. 

Кровь собирали в пробирки с ЭДТА (в качестве базового контроля) и в пробирки Streck BCT. Образцы из пробирок с ЭДТА анализировали сразу после сбора крови и после хранения в течение 7 дней при комнатной температуре. Образцы из пробирок BCT анализировали после хранения при комнатной температуре в течение 2 и 7 дней. 


Количество циркулирующей ДНК в пробирках с ЭДТА сразу после взятия крови приблизительно соответствовало количеству циркулирующей ДНК в пробирках BCT на 2 и 7 день хранения, что составляло 59, 57 и 87 геномных эквивалентов соответственно.
Напротив, в образцах крови, взятых в пробирки с ЭДТА, которые оставлялись при комнатной температуре на 7 дней, количество циркулирующей ДНК было на порядок увеличено (669 эквивалентов генома) в результате лизиса лимфоцитов и высвобождения из них в плазму геномной ДНК (Рис.1).

Рис. 1. Пробирки BCT сохраняют циркулирующую эмбриональную ДНК после 7 дней хранения при комнатной температуре.

 

Геномный эквивалент - "объем" генетического материала, соответствующий одному геному.


Если общее количество циркулирующей ДНК в пробирках с ЭДТА и Streck BCT сильно различалось в различных временных точках, то количество эквивалентов генома для гена E1F1AY Y-хромосомы было приблизительно одинаковым во всех 4 образцах (4, 7, 8, 11 эквивалентов генома соответственно). Эти результаты показывают, что эмбриональная ДНК составляет приблизительно от 6% до 10% общей материнской плазменной ДНК, что согласуется с более ранними сообщениями о процентном содержании ДНК плода в материнской крови.

Кроме того, показано, что отношение ДНК гена E1F1AY Y-хромосомы к ДНК эталонного гена (PIK3CA дикого типа) значительно изменилось из-за увеличения общих эквивалентов генома в результате лизиса клеток. В результате изменилось фракционное содержание гена E1F1AY Y-хромосомы в образце с EDTA, который хранился при комнатной температуре в течение 7 дней.


Оценка стабилизатора геномной ДНК в сохранении циркулирующей ДНК


Специальные пробирки Q. для сохранения геномной ДНК предназначены только для сохранения лимфоцитов и извлечения из них геномной ДНК, а не для стабилизации циркулирующей в плазме ДНК. В принципе, эти пробирки также можно использовать для анализа ДНК плазмы, но они никогда прежде не тестировались для этого применения. 

Была оценена возможность использовать пробирки Q. для анализа циркулирующей ДНК плода. В качестве материала для анализа использовали кровь, полученную у отдельного добровольца. Кровь собирали в пробирки с ЭДТА (в качестве базового контроля), в пробирки Streck BCT (контроль для сравнения) и в пробирки Q. Образцы из пробирок с ЭДТА анализировали сразу после сбора крови. Образцы из пробирок BCT и Q. анализировали после хранения при комнатной температуре в течение 7 дней.


Плазменная ДНК из пробирки BCT, обработанной на 7-й день хранения при комнатной температуре, имела сопоставимые эквиваленты генома с плазмой из пробирки с ЭДТА, собранной в течение 1 часа после венепункции. Напротив, плазменная ДНК из пробирки Q., обработанной на 7-й день хранения при комнатной температуре, показала увеличение на порядок эквивалентов эталонного генома (PIK3CA дикого типа). При этом, геномные эквиваленты гена E1F1AY Y-хромосомы оставались неизменными на 7-й день, аналогично пробиркам с EDTA (Рис.2).

 

Рис. 2. Пробирки BCT сохраняют циркулирующую эмбриональную ДНК после 7 дней хранения при комнатной температуре.


Опухолевая циркулирующая ДНК


Чтобы определить, будут ли вышеописанные результаты стабилизации циркулирующей эмбриональной ДНК также воспроизводимы у онкологических больных, кровь пациентов с метастатическим раком молочной железы исследовали с помощью капельной цифровой ПЦР (ddPCR) и оценивали мутации гена PIK3CA и эквиваленты генома дикого типа.

Кровь у каждого пациента собирали в пробирки с ЭДТА (в качестве базового контроля) и в пробирки Streck BCT и Q. Образцы из пробирок с ЭДТА анализировали сразу после сбора крови. Образцы из пробирок BCT и Q. анализировали сразу после сбора крови и после хранения при комнатной температуре в течение 7 дней. Таким образом, на каждого пациента приходилось по 5 временных точек измерения плазменной ДНК, для каждой точки требовалось 10 мл крови. Поскольку такой дизайн исследования требовал взятия большого (5 × 10 мл = 50 мл) объема крови у одного пациента одномоментно, получение дополнительных образцов крови на пациента было невозможно.


Аналогично результатам для циркулирующей эмбриональной ДНК, было обнаружено, что общее количество ДНК в плазме, хранящейся в течение одной недели при комнатной температуре в пробирках Q., было значительно увеличено относительно базового контроля (ЭДТА после венепункции), показав в среднем 37,14 ± 11,44-кратное увеличение геномных эквивалентов (Таблица 1). Напротив, эквиваленты генома в плазме, хранящейся в течение одной недели в пробирках Streck BCT, увеличились только лишь в 1,17 ± 0,14 раза. Сравнение этих значений было статистически значимым с р<0,0059. По крайней мере, 2 образца продемонстрировали увеличение эквивалентов генома в плазме, собранной в пробирки Q., в ~ 70-100 раз по сравнению с плазменной ДНК соответствующего дня в контрольной пробирке.

Таблица 1. Отношение геномных эквивалентов ДНК плазмы для пробирок Q. и BCT.

Пациент

Экзон

Статус

Q.
день 7 / день 1

BCT
день 7 / день 1

1

9

Дикий тип

11.82

2.07

20

Дикий тип

26.96

2.59

2

9

E545K

0.87

1.45

20

Дикий тип

25.94

0.81

3

9

Дикий тип

6.07

1.40

20

Дикий тип

13.29

0.97

4

9

E545K

1.63

0.86

20

Дикий тип

1.91

1.07

5

9

Дикий тип

16.53

0.74

20

Дикий тип

22.60

0.86

6

9

Дикий тип

80.19

0.38

20

Дикий тип

191.60

1.05

7

9

Дикий тип

23.93

0.46

20

H1047R

33.22

0.48

8

9

Дикий тип

9.00

1.21

20

H1047R

22.79

0.95

9

9

Дикий тип

70.81

1.80

20

Дикий тип

109.33

1.86

В среднем ± SE M

37.14 + 11.44

1.17 + 0.14

р-значение

0.0059


Сравнение средних эквивалентов генома для каждой временной точки каждой пробирки с базовым контролем (ЭДТА после венепункции) показало, что только пробирки Q., обработанные на 7-й день, имели статистически значимое увеличение эквивалентов генома (Таблица 2).

Таблица 2. Статистическое сравнение средних эквивалентов генома плазменной ДНК пациентов для различных пробирок и временных точек.

Экзон 9

Пробирка

ЭДТА День 1

BCT День 1

Q. День 1

BCT День 7

Q. День 7

Среднее

294.89

305.00

244.78

297.33

4442.89

SD

305.74

355.01

270.85

303.81

5243.78

SEM

101.91

118.34

90.28

101.27

1747.93

n

9

9

9

9

9

 

Экзон 9

 

EDTA /BCT
День 1

EDTA / Q.
День 1

BCT День 1 /
BCT День 7

Q. День 1 /
Q. День 7

р-значение

0.78

0.09

0.87

0.04

 

Экзон 20

Пробирка

EDTA День 1

BCT День 1

Q. День 1

BCT День 7

Q. День 7

Среднее

127.78

136.00

134.67

151.11

3248.44

SD

114.55

175.55

165.44

188.40

2857.19

SEM

38.18

58.52

55.15

62.80

952.40

n

9

9

9

9

9

 

Экзон 20

 

EDTA /BCT
День 1

EDTA /
Q. День 1

BCT День 1 /
BCT День 7

Q. День 1 /
Q. День 7

р-значение

0.77

0.76

0.32

0.01


Вышеприведенные результаты не были связаны с техническими проблемами при инкубации ДНК в течение нескольких дней в пробирках Q. Инкубация чистой клеточной геномной ДНК, помещенной в пробирки Q. и обработанной в дни 1 и 7, не показала различий в эквивалентах генома для 9 и 20 экзонов. Клеточную геномную ДНК разрезали в соответствии с инструкциями производителя, поскольку для оптимального включения в капли ddPCR требуются небольшие фрагменты, которые наиболее точно отражают плазменную ДНК.


Выводы


Была оценена возможность стабилизации циркулирующей в плазме ДНК с помощью реагента в пробирках Streck BCT. В качестве группы сравнения использовали реагент для стабилизации клеток из пробирок Q. для выделения геномной ДНК и пробирки с ЭДТА (базовый контроль). Таким образом, задача была поставлена продемонстрировать, что реагент Streck BCT, предназначенный для сохранения именно плазменной ДНК, работает значительно лучше, чем общие клеточные стабилизаторы.

1. Результаты, представленные в этом исследовании, подтверждают, что пробирки Streck BCT можно использовать для сохранения целостности циркулирующей в плазме ДНК, как эмбриональной, так и опухолевой, при хранении крови в течение 7 дней при комнатной температуре. В подавляющем большинстве случаев, в пробирках BCT сохранялись эквиваленты генома, аналогичные базовым контрольным показателям для пробирок с ЭДТА сразу после венепункции. Напротив, анализ пробирок с ЭДТА и Q. обычно приводил к увеличению эквивалентов генома на порядок или более после инкубации образцов крови при комнатной температуре в течение 7 дней.

2. Подтверждено использование пробирок Streck BCT только в течение 7 дней, однако спецификации производителя указывают, что кровь в пробирках Streck BCT может надежно храниться при комнатной температуре до 14 дней без ущерба для целостности циркулирующей ДНК плазмы.

3. В других исследованиях пробирок Streck BCT показано, что условия транспортировки, в диапазоне температур окружающей среды, не оказывают негативного влияния на ДНК плазмы. Однако следует отметить, что пробирки BCT проверены только при температуре от 6 до 37 °C. Следовательно, может потребоваться специальная изоляция при транспортировке в экстремальных погодных условиях. Также образцы крови, собранные в пробирки Streck BCT, не следует хранить в холодильнике и/или морозильнике для клинических образцов, поскольку это вызывает лизис клеток (неопубликованные наблюдения).

4. Пробирки с ЭДТА следует использовать для анализа ДНК плазмы только в случае, если образцы можно обработать в течение 1-2 часов после венепункции.

5. Также следует избегать использования общих клеточных стабилизаторов при сохранении плазменной ДНК.

6. Пробирка Q. специально разработана для сбора внутриклеточных нуклеиновых кислот, которые хранятся при комнатной температуре до 14 дней после сбора крови. В спецификациях производителя также указано, что пробирки можно хранить в холодильнике или замораживать после венепункции с последующей экстракцией геномной ДНК или РНК. Поэтому, с одной стороны, лизис клеток и высвобождение ДНК в плазму не составляет проблему для последующей работы с геномной ДНК или РНК. С другой стороны, высвобождение геномной ДНК из клеток может артефактно увеличить количество геномных эквивалентов внеклеточной плазменной ДНК, что может отрицательно повлиять на абсолютное количественное определение молекул циркулирующей в плазме ДНК. Теоретически, это также может повлиять на чувствительность данного анализа, так как может потребоваться анализ большего количества эквивалентов генома для обнаружения редких молекул, обнаруживаемых в плазме, таких как мутантная опухолевая ДНК (ptDNA).

Таким образом, вышеизложенные данные подтверждают успешное применение пробирок Streck BCT для анализа циркулирующих в плазме эмбриональной и опухолевой ДНК. Пробирки Streck BCT сохраняют целостность эмбриональной и опухолевой ДНК плазмы в образце крови при комнатной температуре через 7 дней после венепункции.

 

Также продемонстрировано, что не все клеточные стабилизаторы подходят для сохранения целостности ДНК плазмы, поскольку отмечен значительный лизис клеток в образцах крови, собранных и проанализированных параллельно с пробирками Streck BCT в аналогичных условиях.

Clin Biochem. 2015 October ; 48(15): 993–998.





Вернуться